GSEA 教學手冊：以 HALLMARK_G2M_CHECKPOINT 為例

GSEA 與 ORA：全名、原理與差別

GSEA 的全名是 Gene Set Enrichment Analysis（基因集富集分析）。ORA 的全名是 Over-Representation Analysis（過度代表性分析），一般說的「GO / KEGG 富集分析」多半就是 ORA。

ORA 會先用 padj < 0.05、|log2FC| > 1 這類門檻切出 DEG 清單，再看通路成員是否在清單裡過多。GSEA 不設門檻，而是把所有基因依差異指標排序，再問整個基因集是否集體往排序榜的某一端靠攏。

ORA 怎麼算

ORA 問的是：顯著基因清單中屬於某條通路的基因，是否比隨機抽樣預期的還多？它用超幾何檢定（hypergeometric test，相當於單尾的 Fisher's exact test）檢查下面這張 2×2 表。

N 是背景基因總數（universe），K 是通路的基因數，n 是 DEG 數，k 是兩者重疊的基因數。p 值是「從 N 個基因隨機抽 n 個，抽中至少 k 個通路成員」的機率：

常見報表中的 GeneRatio = k/n，BgRatio = K/N。如果 GeneRatio 明顯大於 BgRatio，就表示這條通路在 DEG 中過度出現。

兩種方法的比較

Hallmark（MSigDB Collection H）從 MSigDB 數千條彼此重疊的基因集中，歸納出 50 條代表性強、重疊少的基因集，每條代表一個明確的生物狀態或過程。第一輪分析先跑這 50 條，多重檢定的負擔小，結果也比較容易聚焦。

GSEA 標準流程

1. 準備表現資料與分組RNA-seq 計數矩陣或晶片表現矩陣，加上兩組表型標籤（例如 Tumor vs Normal）。GSEA 桌面版用 .gct 與 .cls。
2. 計算排序指標 r_i，產生排序榜 L常用 Signal-to-Noise（桌面版預設）、t 統計量、DESeq2 的 Wald stat，或 sign(log2FC) × −log10(p)。不建議只用 log2FC，因為它不考慮變異度。榜單依 r 由大到小排序，重複的基因符號要先合併。
3. 載入基因集 (.gmt)例如人類 Hallmark 的 h.all.v2024.1.Hs.symbols.gmt（版本號以下載時為準）。通常只保留在資料中有 15–500 個成員的基因集。
4. 沿榜單計算 Running ES，取得 ES成員（Hit）依 |r_i|^p 加權加分，非成員（Miss）平均扣分。標準加權為 p = 1（weighted）。
5. 置換檢定，建立虛無分佈重複 1,000 次。每組 ≥ 7 個樣本時用 phenotype permutation（打亂樣本標籤，保留基因間相關性）；樣本少或用 Preranked 時改用 gene_set permutation。
6. 標準化與校正：NES、nominal p、FDR qNES 用同號虛無 ES 的平均值校正基因集大小的影響，FDR 則把所有基因集一起評估。
7. Leading-edge 分析找出把 ES 推到峰值的核心基因子集。
8. 判讀與驗證依 NES / FDR 篩選，檢查圖形型態，再挑 Leading-edge 基因做 qPCR、Western 或功能實驗。

範例基因集：HALLMARK_G2M_CHECKPOINT

這條基因集有 200 個基因，代表「細胞完成 DNA 複製後、進入有絲分裂前」的檢查點與分裂機器，例如 Cyclin B–CDK1 複合體、啟動分裂的 PLK1 與 AURKA、DNA 損傷時踩煞車的 CHEK1、負責去磷酸化活化 CDK1 的 CDC25 家族，以及紡錘體組裝檢查點的 BUB1、MAD2L1、CDC20。

判讀方式

統計門檻

四種常見曲線型態

判讀檢查清單

• 方向：NES 正負是相對於排序方式。先確認 r 是「處理組 − 對照組」還是反過來，否則上調、下調會整個顛倒。
• 強度與可信度：|NES| > 1.5 且 FDR < 0.25 才進入討論；投稿主要結論最好 FDR < 0.05。
• 形狀：峰是否尖銳、靠邊，條碼是否真的集中在一端。曲線平坦、條碼均勻散佈時，即使 p 值好看也要保留。
• Leading-edge 大小：200 個成員中只有 10 個在 Leading-edge，代表訊號由少數基因帶動，應檢查這幾個基因是否本身就是離群值。
• 冗餘：G2M_CHECKPOINT、E2F_TARGETS、MITOTIC_SPINDLE 同時顯著時，合併成一條「增殖」主線來描述。
• 樣本數與置換方式：每組 < 7 個樣本只能用 gene_set permutation，它忽略基因間的相關性，FDR 會偏樂觀，結論語氣要保守。

實作：R（fgsea + msigdbr）

# DESeq2 結果 res 已備妥（Tumor vs Normal），並已加上基因符號欄 symbol
library(msigdbr); library(fgsea); library(dplyr)

# msigdbr 10 版起，完整資料在另一個套件 msigdbdf，第一次用要先安裝
h  <- msigdbr(species = "Homo sapiens", collection = "H")   # 舊版用 category = "H"
pw <- split(h$gene_symbol, h$gs_name)

rk <- res |> as.data.frame() |> filter(!is.na(stat), !is.na(symbol)) |>
      group_by(symbol) |> summarise(stat = mean(stat))      # 重複基因合併
ranks <- sort(setNames(rk$stat, rk$symbol), decreasing = TRUE)

set.seed(42)
fg <- fgsea(pw, ranks, minSize = 15, maxSize = 500)
fg |> arrange(padj) |> select(pathway, NES, padj, size) |> head(10)

plotEnrichment(pw[["HALLMARK_G2M_CHECKPOINT"]], ranks) +
  ggplot2::labs(title = "HALLMARK_G2M_CHECKPOINT")
fg$leadingEdge[[which(fg$pathway == "HALLMARK_G2M_CHECKPOINT")]]

fgsea 的 padj 是 Benjamini–Hochberg 校正後的 p 值，與 GSEA 桌面版的 FDR q 算法不同，但用途相同。使用 GSEA 桌面版時，建議設定：Permutations 1000、Enrichment statistic weighted、Metric Signal2Noise、Max/Min size 500/15。

常見誤解